Vilniaus universiteto Gyvybės mokslų centro (VU GMC) mokslininkai dokt. Ugnė Gaižauskaitė, dr. Giedrė Tamulaitienė, dr. Arūnas Šilanskas, dr. Giedrius Gasiūnas, prof. Virginijus Šikšnys ir dr. Giedrius Sasnauskas ištyrė, kaip bakterinis baltymas Cas9, geriau žinomas kaip CRISPR-Cas genų žirklės, padeda bakterijoms į genomą įsistatyti jas infekuojančių virusų – bakteriofagų – DNR fragmentus, ir taip įgyti atsparumą virusams.
Mokslininkų darbą aprašantis straipsnis „Cas9 vykdomos skirtukų atrankos mechanizmas CRISPR-Cas adaptacijos metu“ (angl.Structural insights into Cas9-mediated prespacer selection in CRISPR-Cas adaptation) paskelbtas prestižiniame, aukštu cituojamumo indeksu pasižyminčiame žurnale „Molecular Cell“.
Bakterijų imuninės atminties mechanizmas
Pasak dr. G. Sasnausko, CRISPR-Cas sistemos yra vienos iš geriausiai ištirtų bakterijų gynybos nuo virusų – bakteriofagų – mechanizmų. Jų veikimas paprastai skirstomas į tris etapus: adaptaciją, virusą atpažįstančios RNR susidarymą ir apsaugą.
„Dažniausiai kalbama apie paskutinį etapą – kai Cas baltymas atpažįsta ir sukarpo viruso DNR. Tačiau ne mažiau svarbus yra pirmasis žingsnis – adaptacija, kai bakterija apskritai įgyja informaciją apie užpuoliką“, – teigia mokslininkas.
„Adaptacijos metu į specialią bakterijos genomo sritį – CRISPR regioną – įterpiamas maždaug 30 bazių porų ilgio viruso DNR fragmentas, vadinamas skirtuku. Taip bakterija tarsi „įsimena“ užpuoliką. Vėliau nuo CRISPR regiono nurašoma CRISPR RNR (crRNR), kuri kartu su Cas baltymais sudaro apsauginį kompleksą. Ląstelę pakartotinai užpuolus tam pačiam virusui, šis kompleksas atpažįsta jo nukleorūgšties seką ir ją sukarpo. Tai savotiška bakterijos imuninė atmintis, kuri leidžia greitai ir tiksliai atpažinti jau pažįstamą virusą“, – paaiškina dr. G. Sasnauskas.
Cas9 baltymas – daugiau nei genų žirklės
„Iki šiol Cas9 baltymas pirmiausia buvo siejamas su DNR karpymu. Mūsų tyrimai rodo, kad šis baltymas taip pat aktyviai dalyvauja ankstyvajame bakterijų imuninės sistemos etape – naujų genetinės atminties elementų atrankoje ir įrašyme“, – teigia dokt. U. Gaižauskaitė.
„Tyrimo metu paaiškėjo, kad Cas9 kartu su Cas1-Cas2 (baltymais, kurie įterpia DNR fragmentą) ir pagalbiniu baltymu Csn2, sudaro vadinamąjį „superkompleksą“. Šis baltymų ir nukleorūgščių kompleksas atrenka tinkamą viruso DNR fragmentą – būsimą skirtuką – ir padeda jį įterpti į CRISPR regioną“, – paaiškina doktorantė.
Pasak jos, tyrimas leidžia geriau suprasti, kaip evoliucijos metu Cas9 buvo pritaikytas skirtingoms funkcijoms: „Matome, kad tas pats baltymas gali būti naudojamas skirtingiems tikslams – tiek apsaugai nuo virusų, tiek imuninės atminties formavimui“, – teigia dokt. U. Gaižauskaitė.
Struktūriniai tyrimai atskleidė mechanizmo detales
Daugiausia informacijos apie šį procesą suteikė kriogeninės elektroninės mikroskopijos (cryo-EM) tyrimai, atlikti VU GMC veikiančiu Cryo-TEM „Glacios“ mikroskopu – vienu iš moderniausių Lietuvoje mokslinių tyrimų instrumentų, kurio vertė siekia 2,5 mln. eurų.
Naudojant šį mikroskopą straipsnyje aprašyta net 11 skirtingų CRISPR-Cas sistemos baltymų kompleksų struktūrų, tarp jų – trys vadinamojo „superkomplekso“ variantai. Kiekvieną jų sudaro daugiau nei 10 baltymų ir nukleorūgščių komponentų.
Struktūrinė analizė leido pasiūlyti detalų naujo skirtuko atrankos ir įterpimo mechanizmą. Tyrėjai taip pat nustatė iki tol nežinomą žiedo formos baltymo Csn2 funkciją. „Paaiškėjo, kad jis padeda ant viruso DNR fragmento „surinkti“ visus superkomplekso komponentus“, – teigia dr. G. Sasnauskas.
„Struktūriniai duomenys leido pažvelgti į šį procesą beveik atominiu lygmeniu. Tai suteikė galimybę ne tik aprašyti atskirus komponentus, bet ir suprasti, kokiu būdu jie veikia kaip koordinuota sistema“, – pažymi mokslininkas.
Fundamentiniai tyrimai – pagrindas naujoms technologijoms
Šis darbas prisideda prie gilesnio bakterijų imuninės sistemos veikimo supratimo ir atskleidžia naujus CRISPR-Cas sistemos aspektus. Fundamentiniai tyrimai, aiškinantys natūralius molekulinius mechanizmus, dažnai tampa pagrindu naujiems biotechnologiniams sprendimams.
Cas9 baltymas jau iš esmės pakeitė genomų inžinerijos tyrimų lauką. Geresnis supratimas, kaip šis baltymas veikia natūraliose bakterijų sistemose, gali atverti naujų galimybių kurti dar tikslesnius ir universalesnius genų redagavimo įrankius, taip pat plėtoti CRISPR skirtukų įterpimu pagrįstas informacijos saugojimo technologijas.
About the Author
